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      技術文章

      線粒體蘋果酸脫氫酶(MDHm)樣本的前處理

      更新時間:2021-08-26 瀏覽次數:764

      線粒體蘋果酸脫氫酶(MDHm)樣本的前處理:

      組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

      1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器

      或研缽勻漿。

      2、 將勻漿 600g,4℃離心 5min。

      3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。

      4、 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的 α-KGDH(此步可選做)。

      5、 在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或

      200W,超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復 30 次),用于線粒體 α-KGDH 活性測定。

      測定步驟

      1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 340nm,蒸餾水調零。

      2、 樣本測定

      (1)在試劑五中加入 18mL 試劑四充分溶解,置于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)

      水浴 10min;現配現用;

      (2)在試劑六中加入 1mL 蒸餾水,充分溶解待用;現配現用;

      (3)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、10μL 試劑六和 180μL 試劑五,混

      勻,立即記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2,計算 ΔA=A2-A1。

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